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TS-T446

羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

英文名:TRITC Phalloidin

目錄價(jià) ¥800.00
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鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)的環(huán)狀七肽毒素,以高親和力(Kd= 20 nM)選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin,而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合,通常用來標(biāo)記組織切片,細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的F-actin,從而對(duì)F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外,鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維,無論是動(dòng)植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞,按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略,染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯。因此,鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白(Actin)抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小,直徑約12-15Å,分子量<2000 Daltons,未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白(Actin)的許多生理特性都得以維持,比如,同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白,原肌球蛋白,DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng);鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì);以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。

 

鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白(微絲)的解離,穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu),從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度(CC)降至<1µg/mL,因此,可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外,鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actinATP水解活性。

 

本品為TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽,染色反應(yīng)特異性強(qiáng),對(duì)比性高,具有比Actin抗體更好的染色效果,適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。另外,經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性,適用性廣泛。

 

產(chǎn)品性質(zhì):

 分子式  C60H70N12O13S2 
 分子量 1231.40
 最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)(Ex/Em)  540~546/565~575nm
 多肽序列 TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3 to 6)
 外觀  紫色液體
 溶解性  溶于DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液(20%)

 

操作步驟

1.  工作液準(zhǔn)備:對(duì)于TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽。本品以溶于甲醇的20µM儲(chǔ)存液形式提供,總量為300µl。按照100 nM的工作液濃度來換算,可制備總量為60ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對(duì)母液進(jìn)行小量分裝,-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。開始實(shí)驗(yàn)前,使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為:80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。按照100nM濃度來計(jì)算,可進(jìn)行300次細(xì)胞染色。

2.  染色步驟

A:細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h,使其密度達(dá)到50%匯合度。

B:吸掉培養(yǎng)液,37℃預(yù)熱的1×PBSpH 7.4)清洗細(xì)胞2次。

C:使用溶于PBS4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定10min。 【注意】:避免固定劑中含有甲醇成分,因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

D:室溫條件下,用PBS清洗細(xì)胞2~3次,每次10min

E:室溫條件下,用丙酮(≤-20℃)脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

F:室溫條件下,用PBS清洗細(xì)胞2~3次,每次10min

G:取200µl配制好的TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液,覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞,室溫避光孵育30min(通常情況下,4~37℃孵育皆可)。 注意:為了降低背景,可于TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA;另外,孵育過程中為了避免溶液揮發(fā),可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

H:用PBS清洗蓋玻片3次,每次5min。

I:使用200µl DAPI溶液(濃度:100 nM)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染,約30s

J: PBS清洗蓋玻片,然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑,然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存,通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

K: 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察,選擇TRITC激發(fā)/發(fā)射濾片(Ex/Em=545/570nm)和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片(Ex/Em=364/454nm)。

 

注意事項(xiàng)

1:鬼筆環(huán)肽具有毒性,需小心操作(對(duì)人的半數(shù)致死劑量LD502mg/kg)。

2:為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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